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Spectrum:自闭症研究新闻

工具箱 可能促进自闭症研究的新兴工具和技术。

新的基因编辑工具删除了长段DNA

通过 / 2021年11月17日
恢复功能:与传统的CRISPR系统(左)不同,一种新方法(右)可以删除一段DNA,替换缺失的基因部分,恢复基因在小鼠肝脏中的表达(箭头)。

两种新方法使删除长段基因组成为可能,从而扩大了基因分析的能力基因编辑CRISPR.这些技术可能会带来去除与自闭症相关的大量插入或重复的治疗方法,比如潜在的DNA重复脆性X综合征

为了移除DNA片段,CRISPR系统通常使用一种叫做Cas9的酶在两个目标位点上剪切双链DNA。然后,细胞自身的修复机制就可以将切断的两端连接起来,而忽略中间的序列。但这个过程很容易出错,可能会插入或删除被称为“indel”的意外DNA片段,或重新排列基因组的大部分。剪断双链DNA也会导致细胞死亡。

另一种基于crispr的名为“启动编辑”的系统可以使DNA修复更加精确。在该技术的一个版本中,一种被称为“主编辑器”的蛋白质复合物只在两个位点中的一个位点上剪切一条DNA链,在另一个位点上剪切另一条DNA链。主编辑器将一个序列添加到其中一个被切断的线,以指导修复。

与传统CRISPR系统类似,启动子编辑使用一段RNA引导编辑机制到目标序列。但是这个被称为pegRNA的RNA片段也为DNA延伸提供了一个模板,它通常会与相反链上的互补序列结合。如果删除的时间更长,DNA延伸段可能离目标太远,无法引导修复,因此研究人员只能删除长度小于100个碱基或“字母”的序列。

这两项新技术使研究人员能够删除多达1万个DNA字母。两者都在10月被描述自然生物技术

成对':

在第一种方法中,研究人员使用一对pegRNAs指导编辑机械切断相反DNA链上的目标位点,并以特定的序列延伸每条链。他们推断,第二次DNA扩展可能有助于引导第一次DNA在基因组中的结合位置。该团队将扩展程序编程,使其与他们想要删除的序列两侧的DNA互补。当相应的线连接在一起时,它们之间的序列就被删除了。

为了测试这一系统,研究人员创造了一对pegRNAs,旨在删除各种序列——长度从24到10204个字母——并将它们与一个主要编辑器一起发送到一批培养的人类细胞中。为了比较,他们还使用传统的Cas9酶在单独一批细胞中进行相同的缺失。

研究人员称,这种名为PRIME-Del的新方法与传统CRISPR系统工作效率一样高,而且引入的错误大大减少。当他们使用PRIME-Del删除一个长度为10204个字母的序列时,编辑位点附近只有3%的序列包含indel,而用Cas9编辑的序列中有超过一半包含indel。

研究人员还能够在缺失的连接处插入DNA片段。在一项测试中,他们设计了五对pegRNAs,用于删除被称为质粒的DNA环中的一部分基因。每一对还编码了一个3到30个字母长的序列,将其添加到编辑位点的质粒中。

研究小组报告说,同时删除和插入序列造成的错误最小,与单独删除DNA一样有效。利用这种方法,研究人员可以在基因组中引入分子标记,或者避免在DNA被删除时无意中改变基因转化为蛋白质的方式。

与传统CRISPR系统相比,PRIME-Del对细胞的损害也可能更小,因为它不会导致双链DNA断裂。研究人员说,科学家们可以将这种方法与将各种突变引入细胞的检测方法相结合,以研究它们的影响。该团队计划探索基因组的调控区域是如何以这种方式导致自闭症的。

剪切和粘贴:

另一组研究人员开发了一种不同的方法来删除和插入DNA序列。他们的方法叫做PEDAR,替换一个序列在基因组中。

与第一种方法一样,研究人员使用一对pegRNAs护送编辑机器进入他们想要删除的DNA片段的两个位点。然而,一个经过修改的初级编辑器切断了两条DNA链,而不是一条。然后,编辑器将编码新序列的互补单链DNA添加到相反的链上,从而引导修复并替换侧翼序列。

该团队设计了一对pegRNAs,删除了一个基因中991个字母的部分,并用一个18个字母的序列取而代之。然后,他们将pegRNAs与改良的prime编辑器、传统的prime编辑器或Cas9酶结合,并评估每个系统的性能。

只有修改后的prime编辑器删除并插入了目标序列,尽管蛋白质复合物产生意外编辑的速率与Cas9相当。进一步的测试显示,PEDAR还可以编辑更长的序列,插入最多60个字母的片段,删除大约10,000个字母的序列。

在另一项实验中,该团队使用PEDAR编辑了酪氨酸血症小鼠模型中的一个基因,酪氨酸血症是由编码一种酶的基因突变引起的,可导致肝功能衰竭。在小鼠模型中,一个长度超过1000个字母的序列取代了原本应该是19个字母的基因片段,并破坏了其功能。

利用PEDAR删除长插入并替换缺失的片段,研究人员恢复了该基因的功能。研究人员报道,治疗一周后小鼠肝组织的抗体染色显示细胞表达了缺失的酶。

研究人员说,这种新方法可以用于开发针对各种情况的基因疗法。他们正在努力优化系统的效率和准确性。

本文引用:https://doi.org/10.53053/DJPR5209


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